1、常规方法
（1）纸片扩散（K-B）法
由于苯唑青霉素较甲氧西林青霉素稳定，不易失活，通常使用苯唑青霉素代替甲氧西林青霉素测定葡萄球菌。M-H琼脂平板，直接菌落悬液法，苯唑青霉素纸片含量为1ug/片，35℃24小时孵育，抑菌圈直径《10mm
（2）琼脂稀释法
该法被推荐为测定耐甲氧西林葡萄球菌的参考方法，NCCLS推荐M-H琼脂中含苯唑青霉素6ug/ml，并加有NaCL（4%，w/v）对琼脂可进行点接种或用棉拭子蘸取相当于0.5麦氏比浊管的直接菌落悬液进行划线接种。35℃24小时孵育检查琼脂表面有无细菌生长，任何生长表示苯唑青霉素耐药，对于凝固酶阴性葡萄球菌检出耐甲氧西林菌株，需将培养皿孵育48小时。
（3）E-test法
此法是一种定量的方法，是纸片法和稀释法的改良，培养基是M-H琼脂平板，内含2%的NaCL（w/v）接种菌液浓度一般为0.5-1麦氏比浊管。35℃24小时孵育，对于凝固酶阴性葡萄球菌需孵育48小时。由于E-test是基于连续的浓度梯度，因此所得结果可能介于对倍稀释法的两个浓度之间的数值，在作敏感度判断时，将所得值提高到对倍稀释浓度的较高值来解释结果。
2、仪器法
主要使用光测量法，目前半自动、全自动微生物分析仪均可进行测定。
3、分子生物学方法
（1）核酸探针杂交技术
（2）普通PCR技术
β-内酰胺酶检测
1、常规方法
(1)微生物法：
[原理] 以一种对青霉素高度敏感的细菌-枯草芽孢杆菌作为指示剂，试验时如果被测细菌株产生青霉素酶，破坏了青霉素，则此高度敏感菌株即可生长，否则，指示剂则被抑制。
[方法] 以枯草芽孢杆菌为指示菌，用棉拭子将枯草芽孢杆菌接种于琼脂培养基上，或倾注方法将枯草芽孢杆菌混于琼脂平板内。然后将被测菌与产青霉素酶阳性及阴性对照菌株，按下图接种划线，在琼脂培养基中央放置一含青霉素G（1单位）纸片。放置35℃培养24小时后观察结果。
[结果判断] 如被检菌产生青霉素酶，则沿着被测菌处的枯草芽孢杆菌抑菌环出现凹痕。
(2)碘量法[3]
[原理] β-内酰胺酶能裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的兰色复合物，使兰色变为无色。
[方法]
①将0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸盐缓冲液中，使其浓度成6000ug/ml。取0.1ml于一小试管中。
②将培养18-24小时的细菌在含青霉素试管内制成浓厚菌悬液（109/ ml）。
③在37℃水浴中放置30分钟，不时摇动，使酶能破坏青霉素。
④加入1%可溶性淀粉溶液0.5 ml，摇匀。
⑤加入碘液0.02 ml。
⑥在37℃水浴中放置10分钟，观察结果。
[结果] 在10分钟内能使兰色完全消退的菌株为β-内酰胺酶阳性，不消退者为阴性。
[注意事项]
①由于青霉素很容易分解，因而用于实验的青霉素应新鲜配制。
②淀粉也新鲜配制，在100 ml蒸馏水中加入1克可溶性淀粉，放到开水中水浴直到淀粉溶解。
③实验应按照步骤操作，如果碘加得过早，酶反应就会停止，产生假阴性结果。
④每次试验最好用阳性和阴性对照。
（3）纸片酸度定量法[3]
[原理] β-内酰胺酶能破坏青霉素中的β-内酰胺环，形成青霉噻唑酸，使PH降低，指示剂溴甲酚紫颜色由紫变黄。
[方法]
①将一小片Whatman滤纸放于空平皿中。
②让滤纸吸足青霉素溶液（0.05M磷酸缓冲液，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%无缓冲剂的结晶青霉素）。
③用接种环把10-20个菌落涂到滤纸上，
④盖好平皿后，将滤纸片在37℃孵育30分钟，观察结果。
[结果] 产β-内酰胺酶的菌株使滤纸颜色由兰色变黄色，一般在10分钟内即能看到。
（4）产色头胞菌素法[4]
[原理] 产色头胞菌素如头胞硝噻吩（nitrocefin）的β-内酰胺环能被β-内酰胺酶所破坏，使其颜色由浅黄色变为粉红色，以此来测定细菌的产酶情况。
[方法] 将头胞硝噻吩（nitrocefin）纸片置于干净的平皿内，用无菌的牙签或接种环挑取细菌菌落涂于纸片上，观察纸片有无颜色变化。
[结果] 纸片涂抹处如颜色由浅黄色变成粉红色，表示该菌产生β-内酰胺酶，如颜色不变，表示细菌不产生β-内酰胺酶。
检测β-内酰胺酶方法中，生物学方法是古老的方法，由于特异性差、灵敏度低，现在基本上很少被采用，头胞硝噻吩（nitrocefin）主要检测淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉氏菌（布拉汉氏菌）、葡萄球菌，结果可靠。纸片酸度定量法一般用于检测淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌和葡萄球菌。碘量法常用于检测淋病奈瑟氏菌，但莫拉氏菌（布拉汉氏菌）只能用头胞硝噻吩（nitrocefin）法。
对于淋病奈瑟氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉氏菌（布拉汉氏菌）快速测定β-内酰胺酶比做药敏试验能更快地得到临床需要的结果。β-内酰胺酶试验还可验证葡萄球菌对纸片法青霉素的敏感试验结果是否可信。肠杆菌科、假单胞菌科及其它需氧革兰氏阴性杆菌不必测定β-内酰胺酶，因其结果常常不能预测这类细菌对临床常用来治疗β-内酰胺类抗生素药物的敏感性[5]。
超广谱酶检测
1、表型鉴定-纸片法
初筛试验
培养基 Muller-Hinton琼脂
药敏纸片浓度 头孢泼肟 10ug 或 头孢他啶30 ug 或氨曲南 30 ug 或头孢噻肟 30 ug 或头孢曲松 30 ug （使用两个以上纸片做筛选试验可提高检出灵敏度）
接种 按标准纸片扩散法
孵育条件 35℃大气环境
孵育时间 16-18小时
结果 头孢泼肟抑菌环 ≤22mm
头孢他啶抑菌环 ≤22mm
氨曲南抑菌环 ≤27mm
头孢噻肟抑菌环 ≤27mm
头孢曲松抑菌环 ≤25mm
=可能产生ESBL
建议质控方法 大肠埃希氏菌ATCC25922
肺炎克雷伯氏菌 ATCC700603
头孢泼肟抑菌环 9-16mm
头孢他啶抑菌环 10-18mm
氨曲南抑菌环 9-17mm
头孢噻肟抑菌环 17-25mm
头孢曲松抑菌环 16-24mm
表型确证实验
培养基 Muller-Hinton琼脂
药敏纸片浓度 头孢噻肟 30 ug 头孢噻肟/棒酸 30 ug/10 ug和
头孢他啶 30 ug 头孢他啶/棒酸 30 ug/10 ug（确证试验须使用头孢噻肟、头孢他啶及两者与棒酸的混合纸片）
接种 按标准纸片扩散法
孵育条件 35℃大气环境
孵育时间 16-18小时
结果 混合棒酸药物纸片的抑菌圈直径比无棒酸药物纸片的直径大5 mm以上=ESBL
建议质控方法 大肠埃希氏菌ATCC25922单独药物和混合棒酸药物两种纸片的抑菌环直径相差不大于2mm。肺炎克雷伯氏菌 ATCC700603：头孢他啶单独药物和混合棒酸药物纸片抑菌环较头孢他啶单独药物纸片抑菌环直径增大5 mm以上，头孢噻肟单独药物和混合棒酸药物纸片抑菌环较头孢噻肟单独药物纸片抑菌环直径增大3 mm以上。
2、表型鉴定-MIC肉汤稀释法
初筛试验
培养基 CAMHB（调节好阳离子的M-H肉汤）
抗生素浓度 头孢泼肟 1ug/ml 或 头孢他啶1 ug/ml 或氨曲南 1 ug/ml 或头孢噻肟 1 ug/ml 或头孢曲松1 ug/ml （使用1种以上药物做筛选试验可提高检出灵敏度）
接种 按标准肉汤稀释法的规定进行
孵育条件 35℃；空气
孵育时间 16-18小时
结果判读 生长=可疑有ESBLS的产生（即MIC≥2 ug/ml）
质控建议 大肠埃希氏菌ATCC25922不长
表型确证试验
培养基 CAMHB（调节好阳离子的M-H肉汤）
抗生素浓度 头孢他啶0.25-128 ug/ml，头孢他啶/棒酸0.25/4-128/4 ug/ml和头孢噻肟0.25-64 ug/ml，头孢噻肟/棒酸0.25/4-64/4 ug/ml（确证试验须同时使用头孢噻肟、头孢他啶及两者与棒酸的混合纸片）
孵育条件 35℃大气环境
孵育时间 16-18小时
结果判读 对2个中任何一个药物的MIC，在加棒酸后MIC比不加棒酸的MIC值降低3个以上稀释度，判定产ESBLs（如头孢他啶MIC=8 ug/ml，头孢他啶/棒酸1/4 ug/ml
质控建议 肺炎克雷伯氏菌 ATCC700603：联合棒酸的复合制剂的MIC，与单药的MIC相比应当降低3个以上稀释度
诱导酶（inducible beta-lactamases IB）检测
1、纸片法检测：
[原理]诱导酶（inducible beta-lactamases IB）是革兰氏阴性杆菌产生的稳定的β-内酰酶，它是革兰氏阴性杆菌在青霉素、头孢类抗生素作用下产生的，是染色体介导。停用此类抗生素则该酶产量下降，当染色体发生突变后则可稳定产生此酶。
[方法]按常规方法获得的菌株，将菌株接种M-H琼脂上，贴上诱导剂纸片泰能（IPM）和头孢西丁（FOX）两纸片上下相隔20 mm，然后在IPM和FOX左右10 mm边缘处分别贴上基质纸片头孢他啶（CAZ）和头孢噻肟（FTX），IPM 10 ug/片、FOX 30 ug/片、CAZ 30 ug/片、FTX30 ug/片。35℃孵育18小时，由于诱导酶产生，CAZ或FTX的抑菌圈在靠近诱导剂的一面被酶抑制而缩小出现扁平区。
[结果]Sanders等[7]认为；阳性，基质纸片近诱导剂处出现扁平区，基质纸片离诱导剂远侧抑菌圈-近侧抑菌圈≥4mm。阴性，无扁平区或基质纸片离诱导剂远侧抑菌圈-近侧抑菌圈≤4mm。国内蒋燕群[8]采用双纸片法检测120株革兰氏阴性杆菌，检出26株产诱导酶的细菌，并认为诱导剂IPM比FOX好；基质纸片头孢他啶比头孢噻肟好，认为理想的是诱导剂为泰能，基质纸片是头孢他啶且不论该细菌对泰能敏感还是耐药。
2、液体稀释法检测
3、三维实验法检测诱导酶
Coudron等[10]设计利用三维试验检测大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌等产生的诱导酶。
[方法]按标准的纸片扩散法操作，将0.5麦氏比浊单位的E.coli ATCC25922菌液接种于M-H琼脂平皿，取一30ug头孢西叮纸片置于平皿中心，使用自制刀片在离纸片边缘5mm处放射性地由里向外切割一道狭缝，用微量加样枪取40ul酶粗提物由里向外加入狭缝内，尽量避免酶液溢出狭缝。将培养基35℃孵育过夜。若观察到狭缝与抑菌圈交接处出现扩大的长菌区域，视为三维试验阳性。E.cloacae029M作为持续高产的AmpC酶阳性对照，K.pneumoniae700603作为阴性对照。
摘自：中国检验医学网 |